В переводе опущена таблица с клиническими характеристиками пациентов и таблица с характеристиками 112 генов, связанных с процессом апоптоза. Использование термина ''тип саркоидоза'' связано с тем, что авторы использовали не классическую систему рентгенграфических стадий Скаддинга, а классификацию Зильцбаха.

Swiss Med Wkly 2001;131:459–470

Функциональная геномика - апоптоз при саркоидозе усилен или ослаблен ?

Robert M. Rutherfor, Jeanne Kehren, Frank Staedtler, Salah-Dine Chibout, Jim J. G. Egan, Michel Tamm, John J. Gilmartin, Martin H. Brutsche
Dept. of Respiratory Medicine, University Hospital Galway, Ireland, Pneumology, Dept. Internal Medicine, University Hospital Basle, Switzerland, Novartis Pharma AG, Preclinical safety, Toxicology/Pathology, Pharmacogenomics, Basle, Switzerland, Mater Misericordiae Hospital, Dublin, Ireland

Реферат

Введение: многие исследования подчеркнули важность контроля времени жизни воспалительных клеток и баланса анти- и про-апоптических клеточных сигналов. Цель исследования состояла в изучении системной активации путей регулирования апоптоза у пациентов с острым саркоидозом. Методы: мы выполнили геномный анализ с использованием технологии GeneChip (HGU95A, Affymetrix) для исследования экспрессии РНК мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с острым легочным саркоидозом и согласованной здоровой контольной группы. Пациенты (n=12) и контрольная группа (n=12) имели средний возраст 36±12 и 33±10 лет соответственно. Различия были оценены с помощью теста Манна-Уитни. Результаты: 7 пациентов имели болезнь, которая не нуждалась в лечении (тип I саркоидоза) и 5 пациентов имели прогрессирующую болезнь, которая нуждалась в иммуносупресии (тип II или III саркоидоза). Мы обнаружили изменение экспресиии 53 из 112 (47 %) связанных с апоптозом генов у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой. Экспрессия специфических факторов роста (GF), особенно гепарин-связывающего EGF-подобного GF, EGF, PDEGF, SISPDGF2 и VEGF у пациентов с саркоидозом была связана с профилем увеличенной выживаемости клеток. Экспрессия семейства генов Bcl-2 также была связана с профилем увеличенной выживаемости клеток у пациентов с саркоидозом. Напротив, изменение экспрессии другого сигнального рецептора апоптоза, рецептора фактора некроза опухоли I, было совместимо с усилением сигналов апоптоза у всех пациентов с саркоидозом. Другие рецепторы апоптоза, гены каспаз и p53, были одинаково экспрессированы у пациентов с саркоидозом и в контрольной группе. В отличие от пациентов с саркоидозом стадии I, пациенты с прогрессирующим саркоидозом стадии II или III демонстрировали увеличение экспресии NFKB и уменьшение экспресии ингибитора апоптоза 1. Заключение: у мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с острым саркоидозом были обнаружены значительные различия экспрессии генов, связанных с апоптозом. Экспрессия генов не имела специфического паттерна, который был бы строго анти- или про-апоптическим. Однако, число генов, измененная экспрессия которых была связана с увеличенной выживаемостью клеток, было выше, чем число про-апоптических генов. Для изучения процессов апоптоза при саркоидозе необходимы дальнейшие исследования.

Введение

Саркоидоз - хроническая системная болезнь, характеризованная присутствием неказеозных гранулем в пораженных органах [1]. Хотя наиболее важная загадка саркоидоза, его этиология, остается нерешенной проблемой, в последние несколько лет был достигнут значительный прогресс в понимании иммунологических и молекулярных механизмов, ведущих к формированию гранулемы. На участках активности болезни происходит накопление макрофагов и CD4+ T-лимфоцитов, которые затем формируют гранулему [2, 3]. Известные в настоящее время механизмы, участвующие в накоплении этих клеток включают (1) активную миграцию CD4+ T-клеток и моноцитов перферической крови под влиянием мощных факторов хемотаксиса, включая MIP-1, MCP-1, RANTES и IL-8 [4 -9] и (2) in situ пролиферацию лимфоцитов, индуцированную IL-2 [10-13] и, возможно, макрофагов [14].

Однако, механизм, ведущий к персистирующему накоплению воспалительных клеток полностью не изучен. Апоптоз, динамический процесс, который контролирует ''тканевую нагрузку'' эфффекторными клетками на участках воспаления, ограничивает воспалительное повреждение ткани и способствует разрешению воспаления [15, 16]. Действительно ли ослабление процессов апоптоза участвует в патогенезе саркоидоза, неясно. Исследования Fas и/или TNFR1 обнаружили их увеличенную экспрессию на T-лимфоцитах ЖБАЛ [17, 18], предполагая усиление процессов апоптоза. Kunitake [19] обнаружил увеличенное количество клеток, входящих в апоптоз в ткани легкого пациентов с саркоидозом, по сравненению с контрольной группой. Эти результаты также совместимы с усилением апоптоза при саркоидозе. С другой стороны, еще в 1987 г. Cree с коллегами [20] предположили, что процесс апоптоза может коррелировать с активностью болезни и, таким образом, может играть важную роль в исходе саркоидоза.

В процессе апоптоза участвуют множество клеточных сигналов, основными из которых являются рецепторы апоптоза (FAS, TNFR1) [21], p53 [22], семейство генов Bcl-2 [23] и каскад эффекторных протеаз - каспаз [24]. В этих процессах участвуют множество компонентов, которые могут быть анти- и про-апоптическими. Поэтому, ослабление апоптоза может быть результатом уменьшения экспрессии про-апоптических или увеличение экспрессии анти-апоптических сигналов. Большое количество генов, чья различная экспрессия может влиять на выживание клеток в специфических патологических ситуациях, является главной проблемой при попытке анализа нарушения процессов апоптоза, измеряя экспрессию единственного гена. Во-первых, весьма вероятно, что лишь небольшая часть генов будет демонстрировать изменение экспрессии, что делает идентификацию этих генов трудной. Во-вторых, идентификация измененнной экспрессии одного гена не обязательно отражает общий баланс изменения экспрессии про- и анти апоптических генов.

Недавно разработанные протеомные методы с использованием белковых микрочипов позволяют изучать экспрессию нескольких сотен генов рамках одного эксперимента [25 -28]. До настоящего времени, исследований апоптоза при саркоидозе проведено очень мало и они были ограничены экспертизой небольшого числа генов. Используя высокопроизводительную технологию GeneChip мы исследовали клеточные сигналы апоптоза клеток периферической крови пациентов с саркоидозом с самоограниченным и прогрессирующим курсом.

Пациенты

В исследование было включено 12 симптоматических пациентов, у которых острый саркоидоз развился с августа 1999 до мая 2000 г. Все пациенты и согласованая по возрасту и полу контрольная группа не курили, не имели аллергии, злокачественных новообразований, хронических воспалительных болезней и не принимали кортикостероиды. Все пациенты были белыми и дали письменное информированное согласие. Отсутствие аллергических состояний было подтверждено отрицательными результатами тестов на насколько аллергенов (домашние клещи, пыльца растений, кошачья и собачья перхоть).

Диагноз саркоидоз был подтвержден гистологически у 9 пациентов при трансбронхиальной биопсии легкого и у 3 пациентов, имевших узловатую эритему и двустороннюю внутригрудную лимфаденопатию, отношение CD4/CD8 в ЖБАЛ > 3. 5, клинически. Рентгенограммы легких были классифицированы согласно системе, предложенной Зильцбахом [31]. У всех пациентов была исследована функция легких. 7 из 7 пациентов с типом I саркоидоза имели полную ремиссию в течение в течение 12 месяцев, принимая во внимание, что все 5 пациентов с типом II/III болезни имели персистирующие симптомы и все нуждались в иммуносупрессивной терапии.

Результаты

Мы обнаружили значительно измененную экспрессию 53 из 112 (47 %) связанных с апоптозом генов у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой. Изменение экспрессии гена имело однин из трех паттернов: гены, чья экспрессия была изменена при обоих типах саркоидоза (n =14), гены с измененной экспрессией при типе I, но не при типе II/III саркоидоза (n =23) и гены с измененной экспрессией только при типе II/III саркоидоза (n =8). Изменение экспресии 8 генов было статистически значимым только при объединении обоих фенотипов саркоидоза (n =8). Мы не смогли обнаружить гены, экспрессированные исключительно при типе I или типе II/III саркоидоза. Клеточные сигналы, с помощью которых гены с измененной экспрессией участвовали в регулировании апоптоза, представлены ниже.

Гены анти-апоптических цитокинов и гены факторов роста

Факторы роста, экспрессия которых при саркоидозе была изменена, включают гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, эндотелиальный фактор роста клеток 1, тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста клеток, c-sis тромбоцитарный фактор роста 2 и сосудистый эндотелиальный фактор роста. Хотя во всех случаях саркоидоза различия не были статистически значимы, при обоих типах саркоидоза относительные уровни экспрессии имели подобный профиль у пациентов с типом I и типом II/III саркоидоза. Экспрессия гепарин-связывающиео EGF-подобного фактора роста и сосудистого эндотелиального фактора роста коррелировали с ухудшением функции легкого, DLCO, FEV1 и FEV1, FVC, соответственно.

TNF и другие клеточные сигналы апоптоза

Увеличенные уровни TNFA (только II/III тип саркоидоза), TNFR1, TNFA-индуцированного белка A20 и TSG-14 (только тип I саркоидоза) характеризовали усиление клеточных сигналов TNF. Сигнал TNFR ведет к активации / пролиферации клеток или стимулирует апоптоз. Однако, критически важным элементом в этом процессе являются внутриклеточные адапторные молекулы. Мы обнаружили уменьшенные уровни ингибитора апоптоза (IAP) при типе I, но не при типе II/III саркоидоза и уменьшение уровней TRAF5 при обоих фенотипах саркоидоза. Это указывает, что активация клеток TNF-зависимыми клеточными путями не активна, особенно при самоограниченном типе I саркоидоза. FADD, молекула, необходимая для индукции апоптоза, не была дифференциально экспрессирована при двух типах саркоидоза. Экспрессия адаптерных молекул апоптоза RAIDD и белка GADD34 (только при типе II/III) была увеличена, указывая на усиление апоптоза, связанного с клеточными сигналами TNF. Подобная экспрессия внутриклеточных адаптерных молекул совместима скорее с усилением апоптоза, чем с пролиферацией, регулируемой клеточными сигналами TNF при обоих типах саркоидоза. Однако, главным различием клеточных сигналов TNF и между двумя фенотипами саркоидоза, была более высокая экспрессия TNFA и NFKB при типе II и III болезни, указывая на более интенсивную активацию и пролиферацию клеток по сравненению с типом I болезни.

С другой стороны, не имелось никаких свидетельств дифференциальной экспрессии Apo3L, Fas (CD95) /FasL, TNF-связанных апоптоз-индуцирующих лигандов TRAIL, TRAIL2 и TRAIL3, рецептора DECOY2 и TNF-связанного рецептора 6. Экспрессия растворимой формы рецептора домена 3 была значительно уменьшена при обоих типах саркоидоза.

Каскад каспаз

Каскад каспаз не демонстрировал дифференциальную экспрессию у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой.

Bcl-2 семейство

Мы измерили экспрессию 19 анти-апоптических и 10 про-апоптических членов семейства Bcl-2. Экспрессия 5 из 19 анти-апоптических членов семейства Bcl-2 была уменьшена, экспрессия 4 из которых (BCL2B, BCL2E1B, BCL6, BFL1) была совместима с ослаблением апоптоза у пациентов с саркоидозом. Была увеличена экспрессия единственного про-апоптического гена семейства Bcl-2, BAX дельта. Таким образом, экспрессия генов семейства Bcl-2 демонстрировала анти-апоптический профиль.

P53

При саркоидозе не было обнаружено никаких свидетельств повреждения ДНК или окислительного стресса. Ген атаксии-телангиэктазии ATM, индуцированный повреждением ДНК, демонстрировал уменьшенную экспрессию при саркоидозе (RE =0. 63). Гены p53-нейтрализующего белка MDM2A, D, E и MDMX были экспрессированы одинаково.

Обсуждение

Недавно, ослабление апоптоза было предложено как один из механизмов, способствующих накоплению воспалительных клеток при саркоидозе [34]. Однако, исследования Fas и TNFR1 в ЖБАЛ и ткани легкого указывали на усиление апоптоза у пациентов с саркоидозом по сравнению с здоровой контрольной группой [17 -19]. Было предположено, но не проверено в исследованиях, что ослабление апоптоза происходит при более серьезной болезни, по сравнению с пациентами с умеренными формами саркоидоза и, поэтому, может вносить вклад в серьезность болезни [20]. Применяя функциональную геномику мы обнаружили изменение экспрессии нескольких генов, связанных с апоптозом у мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с саркоидозом. Эти изменения экспрессии генов могли быть связаны с генетическими факторами или факторами окружающей среды. Хотя изменения экспрессии генов факторов роста показали анти-апоптический паттерн, ситуация с другими генами не была столь очевидной.

Паттерн экспрессии генов факторов роста и анти-апопотических генов у пациентов с саркоидозом был связан с профилем увеличенной выживаемости клеток. Наблюдалось особенно значительное изменение экспрессии генов гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста, эндотелиального фактора роста клеток 1, тромбоцитарного эндотелиального фактора роста клеток, c-sis тромбоцитарного фактора роста 2 и сосудистого эндотелиального фактора роста. Экспрессия гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста и сосудистого эндотелиального фактора роста коррелировали с ухудшением функции легкого и, таким образом, могли служить маркерами серьезности болезни. Экспрессия VEGF, который может быть индуцирован TNFA, IL-1 и членами семейства фактора роста фибробластов [35], была увеличена при обоих фенотипах саркоидоза. VEGF может быть ингибирован высокими дозами дексаметазона [36, 37]. VEGF экспрессируется различными типами клеток, включая эндотелиальные клетки и является критически важным для хемотаксиса фибробластов и ангиогенеза. VEGF участвует в ремоделировании ткани легкого и его увеличенная экспрессия была отмечена у пациентов с хронической воспалительной болезнью легкого и при гипоксии [38].

Фактор некроза опухоли также может стимулировать активацию клеток в NFKB-зависимыми путями или участвовать в передаче клеточных сигналов апоптоза посредством каскада рецепторов TNFR I, TRADD и каспаз [21, 24]. Различные внутриклеточные адаптерные молекулы играют важную роль в этих процессах. Экспрессия генов TNF и связанных сигнальных генов совместима с усилением сигналов апоптоза при обоих фенотипах саркоидоза. Однако, по сравненению с пациентами с саркоидозом, проходящим без лечения, у пациентов с типом II и III болезни наблюдается усиление клеточных сигналов активации / пролиферации, на что указывает существеное изменение экспресии NFKB только у этих пациентов. Роль дефицита ингибитора апоптоза IAP1 при типе II/III саркоидоза остается неясной, но может быть возможным объяснением различий, наблюдаемых между двумя фенотипами саркоидоза. Интересно, что экспрессия этого гена также коррелирует с функцией легкого.

В отличие от очевидной активации сигналов TNF, все другие рецепторы апоптоза, а именно Apo3L, Fas (CD95) /FasL, TNF-связанный апоптоз-индуцирующиие лиганды TRAIL, TRAIL2 и TRAIL3, рецепторы DECOY2 и TNF-связанный рецептор 6, не демонстрировали дифференциальную экспрессии. Значение уменьшения экспрессии растворимой формы рецептора домена 3 остается неясным.

Из 19 членов семейства Bcl-2, экспрессия четырех была увеличена и только экспрессия BCL9 была уменьшена. Таким образом, экспрессия генов семейства Bcl-2 демонстрировала анти-апоптический профиль. Экспрессия только 1 из 10 про-апоптических генов семейства Bcl-2, BAX дельта, был немного увеличенной (RE 1.15). Однако, BAX дельта не способен взаимодействовать непосредственно с APAF1, который является обычным участком сцепления генов Bcl-2 и регулировать активность CASP9. BAX дельта проявляет про-апоптический эффект, связываясь с белками Bcl-2, которые по этой причине становятся неспособны связывать APAF1.

Мы не обнаружили никаких свидетельств повреждения ДНК или окислительного стресса. Ген атаксии-телангиэктазии ATM, индуцированный повреждением ДНК, демонстрировал уменьшенную экспрессию при саркоидозе. Гены p53-нейтрализующего белка MDM2A, D, E и MDMX были экспрессированы одинаково.

Обнаружение, что экспрессия эффекторных протеаз апоптоза, каспаз, не была изменена при саркоидозе не удивительно, поскольку известно, что они в большом количестве производятся при апоптозе и когда активизируются, стимулируют апоптоз в пределах нескольких минут без необходимости любой транскрипционной активности.

Потенциальным недостатком нашего исследования является анализ периферической крови, хотя активность болезни преобладает в легком. Действительно, картина в периферической крови может быть зеркальной по отношению к легким, где клетки, модулирующие болезнь, мигрировали в ткань. Кроме того, известно, что при саркоидозе имеется компартметализация иммунного ответа [40] и что состояние мононуклеарных клеток периферической крови не отражает эти события, хотя некоторые исследования не подтверждают это.

Саркоидоз - системная болезнь, производящая активацию многих генов в различных органах. Таким образом, достаточно большое количество местных воспалительных реакций отражается в периферической крови, которая приблизительно один раз в минуту циркулирует через легкие. Поэтому, мы выдвигаем гипотезу, что первичное изменение экспресии генов, генетически детерминированное или вызванный факторами окружающей среды, также присутствует на отдаленных от фактического участка воспаления - легкого. Вклад различных типов клеток в специфический паттерн экспрессии генов должен быть исследован в ткани легкого, жидкости бронхоальвеолярного лаважа и периферической крови.

Другим ограничением нашего исследования является рассмотрение исключительно экспрессии генов, вследствие чего мы не можем делать никаких утверждений относительно активности сигнальных путей апоптоза. Поэтому, в дальнейших исследованиях эти данные должны быть объединены с анализом белков, участвующих в процессе апоптоза, включая активность каспаз.